“血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织
概要:粗分离:将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋,按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0),透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质,二是使血红蛋白处于缓冲液环境中,便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。 纯化:可采用柱型为Sephadex G75,柱体积为500 mL的色谱柱;加样量为10 mL(约含蛋白200 m g);用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)进行洗脱,洗脱速度可控制为0.5 mL /min,即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测,如果测得的数值很高,说明蛋白含量过高,此时需要进行稀释。下图是将每管取0.5 mL
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粗分离:将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋,按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0),透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质,二是使血红蛋白处于缓冲液环境中,便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。 纯化:可采用柱型为Sephadex G75,柱体积为500 mL的色谱柱;加样量为10 mL(约含蛋白200 m g);用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)进行洗脱,洗脱速度可控制为0.5 mL /min,即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测,如果测得的数值很高,说明蛋白含量过高,此时需要进行稀释。下图是将每管取0.5 mL稀释10倍后,用紫外线测量的结果(如下图)。 由图中数值可知,33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值,选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。 纯度鉴定:经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定,以下是实验操作流程。


课时安排 | 授课或实验内容 | 补充说明 |
第1~2课时 | 讲授凝胶色谱法和电泳的基本原理 | 透析和平衡凝胶需要的时间较长,可由教师完成; 电泳可由教师演示完成 |
第3课时 | 进行样品的处理(洗涤、释放、分离和透析) | |
第4课时 | 运用凝胶色谱法对血红蛋白进行纯化 | |
增加1课时 | 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白质进行纯度鉴定 |
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