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“血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织

[09-29 00:39:44]   来源:http://www.5ijcw.com  高二生物教学设计   阅读:8908

概要:粗分离:将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋,按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0),透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质,二是使血红蛋白处于缓冲液环境中,便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。 纯化:可采用柱型为Sephadex G75,柱体积为500 mL的色谱柱;加样量为10 mL(约含蛋白200 m g);用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)进行洗脱,洗脱速度可控制为0.5 mL /min,即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测,如果测得的数值很高,说明蛋白含量过高,此时需要进行稀释。下图是将每管取0.5 mL
“血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织,标签:高二生物教学设计案例,http://www.5ijcw.com
粗分离:将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋,按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0),透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质,二是使血红蛋白处于缓冲液环境中,便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。   纯化:可采用柱型为Sephadex G75,柱体积为500 mL的色谱柱;加样量为10 mL(约含蛋白200 m g);用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)进行洗脱,洗脱速度可控制为0.5 mL /min,即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测,如果测得的数值很高,说明蛋白含量过高,此时需要进行稀释。下图是将每管取0.5 mL稀释10倍后,用紫外线测量的结果(如下图)。      由图中数值可知,33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值,选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。   纯度鉴定:经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定,以下是实验操作流程。       脱色的目的是脱去背景颜色以体现出蛋白条带。一般来说,条带分明,目的条带清晰,无扩散,前沿比较直,说明实验结果比较好,样品比较纯,下面为兔血实验的电泳结果图。     5.课时安排及实施建议   本课题可安排4~5课时。教师可在实验前配制好磷酸缓冲液,并购买或制作好凝胶色谱柱,以备实验时使用。
课时安排 授课或实验内容 补充说明
第1~2课时 讲授凝胶色谱法和电泳的基本原理 透析和平衡凝胶需要的时间较长,可由教师完成; 电泳可由教师演示完成
第3课时 进行样品的处理(洗涤、释放、分离和透析)
第4课时 运用凝胶色谱法对血红蛋白进行纯化
增加1课时 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白质进行纯度鉴定
由于大多数学校缺乏相应的实验设备,操作难度较高,因此,本实验可由教师以讲清实验原理和演示操作为主,并配以相应的实验录像进行教学。   6.教学体会   本课题的实验操作相对复杂,影响实验效果的关键环节之一是凝胶色谱柱的制作和装填,对实验者的操作有很高的要求,建议有条件的学校直接购买商品色谱柱。由于甲苯是剧毒试剂,不太适合在中学实验中使用,因此,我们尝试在血红蛋白的释放时,只使用蒸馏水使细胞涨破,也获得了很好的实验效果。电泳过程中制胶、染色和脱色耗时较多,建议由教师完成,其他环节由师生共同完成。此外,本课题也可选用鸡血或猪血作为实验材料。 


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